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微生物多樣性

微生物多樣性技術介紹

微生物多樣性分析是以研究環境中微生物的種類和數量為目的,揭示隨環境變化導致微生物群落結構變化的過程。其研究對象廣泛,包括土壤、水體、發酵液、植物表面、動物胃腸道、皮膚等。

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研究對象

實驗設計到信息分析一站式服務

提供全面的微生物多樣性研究的方案設計和售后服務,豐富的標準分析以及個性化分析多角度闡明環境微生物變化規律。

  • 方案確定

  • 提取檢測

  • 建庫測序

  • 信息分析

  • 售后服務

技術策略與送樣要求

?測序策略

Illumina Hiseq 2500 PE250測序

?DNA送樣要求

DNA濃度?≥10ng/μl(Qubit),DNA質量≥500ng(Qubit),DNA電泳條帶清晰,無降解或者輕度降解。

環境樣品取樣方法及送樣要求

糞便:清晨采集新鮮糞便樣品,放于無菌離心管或其它無菌容器中,樣品帶回實驗室后分裝至無菌離心管或凍存管中,每份樣品5g左右即可,液氮速凍3-5min-80°C長期保存,干冰運輸送樣。

腸道內容物:無菌條件下對動物個體進行處理,用75%酒精擦拭體表,用無菌解?? 剖剪剪開動物腹部,取出胃腸道等目的器官,用PBS進行清洗,離心收集沉淀,分裝于2 mL離心管中;迅速置于液氮中冷凍 3~4 小時,然后轉移至-80°C 或液氮中長期保存,干冰運輸。

土壤:選取采樣地點,可多點采樣法進行取樣,除去土壤表層未分解的凋落物層,采集土壤5g左右;樣品帶回實驗室后過2mm 篩后;分裝至無菌EP管或凍存管中,迅速置于液氮中冷凍 3~4 小時,然后轉移至-80°C 或液氮中長期保存,干冰運輸。

污泥:選取污泥樣本于無菌離心管或其它無菌容器中,樣品帶回實驗室后分裝至無菌離心管或凍存管中,每份樣品5g左右即可,液氮速凍3-5min-80°C長期保存,干冰運輸送樣。

水體:對于水質較為清澈(目測)的或微生物含量極其稀少的水樣如:自來水、井水、泉水等,用采集回來的水樣樣品 1L 通過 0.22μm 的微孔濾膜真空過濾,水樣中的總微生物被富集在濾膜表面,濾膜與無菌管中,液氮速凍,干冰運輸。

發酵液:對于水質較為混濁的(或微生物含量較為豐富的發酵液)水樣,三點水樣混合搖勻后取80mL分裝在兩個無菌的50mL的離心管,每個分裝40mL,防止分裝過滿,水樣冰凍后體積膨脹,導致離心管破裂,被其它微生物群體污染。液氮速凍3-5 min-80℃保存。

皮膚:采用無菌棉簽或無菌手術刀片輕輕刮取皮膚表面取樣,取樣后將棉簽置于無菌的離心管,液氮速凍,-80℃長期保存;如果研究正常情況下皮膚微生物,取樣前24h不能洗澡,不能使用潤膚乳及抗菌活性的肥皂等。

產品優勢與項目經驗

豐富的項目經驗與專業的信息團隊,提供全面準確的信息分析。

高水平分析團隊

豐富的項目經驗

全面的分析內容

專業的售后服務

成功案例

數據質控

數據下機后根據PE reads之間的Overlap關系,將Hiseq測序得到的雙端序列數據拼接(Merge)成一條序列Tags,同時對Reads的質量和Merge的效果進行質控,主要包括去除低質量Tags和去嵌合體

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物種注釋

根據97%的相似度進行OTU聚類后,基于Silva(細菌)和UNITE(真菌)分類學數據庫對OTU進行分類學注釋,得到每個OTU對應的物種分類信息,進而在各水平(phylum,class,order,family,genus,species)統計各樣品群落組成,繪制樣品在各分類學水平下的群落結構柱狀圖,柱狀圖展示不同樣品中物種的組成和相對豐度。

主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)

PCA是一種分析和簡化數據集的技術,通過將方差進行分解,將多組數據的差異反映在二維坐標圖上,通過分析不同樣品 OTU(97%相似性)組成可以反映樣品的差異和距離,PCA運用方差分解,將多組數據的差異反映在二維坐標圖上,坐標軸取能夠最大反映方差的兩個特征值。圖中兩個樣品距離越近,則表示這兩個樣品的組成越相似。

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Alpha多樣性分析

Alpha多樣性(Alpha diversity)反映的是單個樣品內部的物種多樣性,有多種衡量指標:Chao1AceShannonSimpson。Chao1和Ace指數簡單的反映出群落中物種的數量;Shannon和Simpson指數用于衡量群落多樣性,受樣品群落中物種豐度和物種均勻度(Community evenness)的影響。Chao1、Ace、Shannon指數值越大,Simpson指數值越小,說明樣品的物種多樣性越高。另外還統計了樣本文庫的覆蓋率 Coverage,其數值越高,則樣本中序列被測出的概率越高,而沒有被測出的概率越低。

Beta多樣性分析

Beta多樣性分析主要采用 binary jaccardbray curtisweighted unifrac(限細菌)、 unweighted unifrac (限細菌)等4種算法計算樣品間的距離從而獲得樣本間的β值。這四個算法主要分為兩大類:加權(Bray-Curtis和Weighted Unifrac)與非加權(Jaccard和Unweightde Unifrac)。利用非加權的計算方法,主要比較的是物種的有無;而加權方法,則需要同時考慮物種有無和物種豐度兩個問題。樣品間距離越小,說明兩個群體的物種組成越相似。

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LEfSe分析

LEfSe(Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size)分析主要用于發現不同組間具有統計學差異的Biomarker,根據設定的Biomarker篩選標準(LDA score>4)找出符合條件的Biomarker。

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16S功能預測

16S功能預測基于PICRUSt軟件通過比對16S測序數據獲得的物種組成信息,推測樣本中的功能基因組成,從而分析不同樣本或分組之間在功能上的差異。

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相關性分析

網絡圖是相關性結果的一種表現形式,根據各個物種在各個樣品中的豐度以及變化情況,使用sparcc算法進行相關分析,圖中線的粗細代表相關性的強弱;線的顏色表示相關性:紅色代表正相關,綠色代表負相關。

Q1.微生物多樣性中OTU是指什么?

OTU(Operational Taxonomic Unit )即分類操作單元,是在系統發生學研究或群體遺傳學研究中,為了便于進行分析,人為給某一個分類單元(品系,種,屬,分組等)設置的同一標志。在微生物多樣性分析中,根據不?同的相似度水平,對所有序列進行OTU劃分,一般情況下,如果序列之間的相似性高于97%?(種水平)就可以把它定義為一個OTU,每個OTU代表一個物種。

Q2.Beta多樣性四種距離算法的差異?

Beta 多樣性分析主要采用 binary jaccard bray curtis unweighted Unifrac(限細菌)weighted Unifrac (限細菌)4種算法計算樣品間的距離,那么這四種算法都有什么差別呢?

非加權的計算方法,主要考慮的是物種的有無,即如果兩個群體的物種類型都一致,表示兩個群體的樣本距離最小;加權方法,則同時考慮物種有無和物種豐度兩個問題。比如如樣品A3個物種a2個物種b組成,樣品B2個物種a3個物種b組成,則通過非加權方法計算,因為樣品A與樣品B的物種組成完全一致,都只由物種ab組成,因此它們之間的樣本距離為0。但通過加權方法計算,雖然樣品A與樣品B的物種組成一致,但物種ab的數目卻不同,因此兩個群體的β多樣性則并非一致。

基于獨立OUT的方法認為OTU之間不存在進化上的聯系,每個OTU間的關系平等;基于系統發生樹計算的方法,會根據16s的序列信息對OTU進行進化樹分類, 因此不同OTU之間的距離實際上有“遠近”之分。

Q3.PCA與PCoA的區別?

主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)是一種分析和簡化數據集的技術,通過將方差進行分解,將多組數據的差異反映在二維坐標圖上;主坐標分析法(Principal coordinates analysis,PCoA)是一種與 PCA 類似的降維排序方法。PCoA與PCA的區別在于PCA是基于原始的物種組成矩陣所做的分析,使用的是歐式距離,僅僅比較的是物種豐度的不同,而PCoA首先根據不同的距離算法計算樣品之間的距離,然后對距離矩陣進行處理,使圖中點間的距離正好等于原來的差異數據,實現定性數據的定量轉換。

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